PCR dúplex a tiempo real para la detección de la variante clásica (RHDV) y nueva (RHDV2) de la enfermedad hemorrágica del conejo

Abstract

La enfermedad hemorrágica (RHD) es uno de los principales factores de mortalidad del conejo silvestre en la península ibérica. Desde su aparición a finales de los años 80 el agente etiológico predominante han sido cepas víricas pertenecientes a un único genogrupo (RHDV). Sin embargo, en 2011 se detectó, inicialmente en el tercio norte de España, una nueva variante vlrica (RHDV2) que cursó de forma atlpica, modificando la epidemiologla de la enfermedad y afectando a animales con menos de 30 días de edad. Entre los años 2009 y 2016 se ha estudiado la epidemiologia de la RHD en cuatro poblaciones experimentales de conejo silvestre mediante captura-recaptura, encontrándose en 2011 el primer aislado de RHDV2 en estas poblaciones (Calvete et al., 2014). Debido a la necesidad de llevar a cabo un diagnóstico rápido y sensible de las dos variantes y estudiar la epidemiologia de la enfermedad antes y después de la aparición del RHDV2, se presenta en este trabajo la puesta a punto de un protocolo que permite identificar los dos genotipos de la enfermedad (RHDV y RHDV2) mediante PCR dúplex a tiempo real (qPCRdúplex).

RHDV2 genotypes of the rabbit haemorrhagic disease (RHD) in the sama assay. The primers and probes target sequences are conserved in all samples analysed showing 100% sensitivity and specificity, being all RHDV or RHDV2 isolates correctly genotyped by duplex-qPCR according to their sequence data. Standardisation was performed using standard curves. Efficiencies ranged from 2.01-2.04 and 1.96-1.98 for the RHDV and RHDV2 genotypes, respectively, and correlation of 0.99 for both genotypes reflecting a good linearity of the standard curve. High repeatability and reproducibility of the assay was found with very low variation, with CV lower than 1.89 and 1.21% for RHDV and RHDV2, respectively. The sensitivity of detection was higher far the duplex-qPCR assay than a direct ELISA assay.